Comment séparer des acides aminés dans un mélange ?
Séparation d'acides aminés: chromatographie
Principe : La chromatographie est basée sur les solubilités différentes des molécules entre deux solvants : dans un mélange de solvants non miscibles, un soluté se dissout en plus grande quantité dans le solvant pour lequel il a le plus d'affinité.
En migrant à travers un support, le solvant entraîne avec lui les solutés qui y sont solubles. Les solvants sont choisis de façon à ce que l'un des deux s'adsorbe("reste collé") plus fortement au support. Les molécules les plus solubles dans ce solvant seront donc retardées par rapport à celles solubles dans l'autre solvant.
Réalisation pratique :
La cuve à chromatographie est préparée 24 h à l'avance avec 1cm de solvant au fond. Elle est fermée hermétiquement avec le film plastique
1- Préparer la feuille à chromatographie :
- découper un rectangle de 16 x 14 cm,
- tracer un léger trait de crayon à 1,5 cm du bord inférieur du rectangle: sur ce trait seront déposées les microgouttes. Un espace d'au moins 2,5 cm doit être respecté entre les gouttes. La première et la dernière doivent être déposées au moins à 2 cm du bord vertical.
2 - Déposer les microgouttes :
- déposer une microgoutte un peu au dessus du trait; sécher au sèche-cheveux puis en déposer une autre par dessus, sécher,... On peut aller jusqu'à 4 ou 5 gouttes superposées.
- procéder ainsi pour chaque solution : le mélange à séparer plus des solutions témoins avec des acides aminés connus.
3 - Faire un cylindre avec la feuille à chromatographie. Mettre une agrafe à la partie supérieure (ou un trombone); lorsque les 2 bords du rectangle sont proches (éviter un trop grand chevauchement)...une deuxième agrafe au bord inférieur n'est pas nécessaire: on a alors un cône.
4 - Placer ensuite le cylindre (le cône) dans la cuve en l'appuyant contre un bord.
En aucun cas, le solvant ne doit atteindre les microgouttes séchées; il doit le faire par capillarité.
Refermer immédiatement la cuve.
5 - Au bout d'une heure, sortir le cylindre. Découper le papier autour de l'agrafe pour le dérouler. Sécher complètement à l'aide du séchoir à cheveux le chromatogramme en évitant de le déchirer. Le fixer sur un support en bois avec les punaises.
6 - Révéler (à ne pas faire faire aux élèves): vaporiser sous la hotte la solution de ninhydrine sur le(s) chromatogramme(s).
7 - Sécher à l'air sous la hotte, puis attendre une demi-heure avant d'interpréter le chromatogramme.